INTRODUZIONE
La scoperta dell'esistenza di due isoforme dell'isoenzima MB della creatinchinasi (CK-MB) è avvenuta nel corso degli anni '70. Numerosi autori, utilizzando differenti metodi di separazione, hanno dimostrato l'esistenza di queste isoforme, denominate CK-MB1 e CK-MB2 in base alla loro mobilità elettroforetica verso l'anodo (1). Il loro significato clinico è stato soprattutto riferito all'uso del rapporto tra la forma nativa tissutale, CK-MB2, e quella che a livello ematico deriva dalla rimozione da questa di una molecola di lisina ad opera della carbossipeptidasi N plasmatica, denominata CK-MB1. Nei soggetti sani la velocità di rilascio nel sangue della CK-MB tissutale (CK-MB2) è bilanciata dalla sua velocità di conversione e di scomparsa dal circolo ad opera della carbossipeptidasi N; in questo caso, le due isoforme si trovano quindi nel siero in concentrazioni molto basse ed in quantità pressoché uguali.
Nell'infarto miocardico acuto (IMA), invece, in seguito al danno cellulare, che comporta un rilascio massivo dell'isoforma tissutale CK-MB2, si ha un innalzamento del rapporto MB2/MB1, che si normalizza successivamente con l'andare del tempo. Come detto, responsabile della formazione dell'isoforma plasmatica è la carbossipeptidasi N (EC 3.4.17.3), enzima tetramerico di origine epatica, normalmente presente nel siero dove catalizza l'idrolisi di amminoacidi basici dall'estremità C-terminale di peptidi vasoattivi, come la bradichinina e i fattori del complemento C3a e C5a. E' stato dimostrato che l'attività plasmatica di questo enzima è funzione dello stato di salute del soggetto, dal momento che aumenti sono stati riscontrati in pazienti con tumori, patologie infiammatorie e in corso di gravidanza, mentre diminuzioni si sono osservate in corso di epatopatie (1).

LE ISOFORME DELLA CK-MB NELLA DIAGNOSI DI INFARTO MIOCARDICO
Per la diagnosi di IMA, il rapporto MB2/MB1 rappresenta un marcatore precoce: esso possiede infatti tempi di positivizzazione, tempi di raggiungimento del picco e di normalizzazione più brevi rispetto a quelli dell'isoenzima CK-MB (Tabella 1). In un nostro studio, in particolare, sono stati messi a confronto la CK totale, la CK-MB determinata in attività e in concentrazione di massa, le isoforme della CK-MB, la mioglobina e la troponina T cardiaca (cTnT) in dieci pazienti con IMA ricoverati entro 6 ore dall'insorgenza dei sintomi (3).
In tre di questi, con un tempo dal dolore compreso tra 0.5 e 1.5 ore, la concentrazione di tutti i marcatori è risultata inferiore al livello decisionale; in due pazienti, il danno miocardico è stato rilevato prima dalla mioglobina rispetto agli altri marcatori, mentre in altri due soggetti solo la mioglobina e le isoforme risultavano superiori al livello decisionale, a conferma del fatto che questi due rappresentano i marcatori più precocemente sensibili tra quelli valutati (3).
Relativamente alla cardiospecificità delle isoforme della CK-MB, è ben conosciuto che l'isoenzima CK-MB, da cui queste originano, è presente, oltre che nella muscolatura cardiaca anche in quella scheletrica, in una percentuale variabile dal 1 al 3%. Le isoforme della CK-MB ovviamente risentono di questa distribuzione tissutale ed infatti valori di rapporto MB2/MB1 >1.5 sono stati riportati anche in soggetti con trauma muscolare o dopo prolungato esercizio fisico (4).
Complessivamente, si può affermare, in accordo con Bhayana et al. (5), che, nell'intervallo di tempo compreso tra 3 e 6 ore dall'insorgenza dei sintomi, l'efficienza diagnostica complessiva delle isoforme della CK-MB per la diagnosi di IMA risulta buona [area sotto la curva caratteristica operativa (ROC), 0.88] e assolutamente confrontabile con quella della CK-MB massa (area sotto la curva, 0.88).

ALTRI CAMPI DI APPLICAZIONE DELLEISOFORME DELLA CK-MB
Un altro ambito in cui le isoforme dell'isoenzima MB, come peraltro anche altri marcatori di lesione cardiaca, possono trovare un'applicazione pratica è rappresentato dal monitoraggio dell'efficacia della terapia trombolitica. La valutazione dei tempi medi di raggiungimento del picco da parte delle isoforme della CK-MB evidenzia una differenza significativa tra pazienti riperfusi e non riperfusi (6). Inoltre, per tale problematica, un tipo di approccio alternativo, sicuramente più utile ai fini di una decisione clinica poiché fornisce un'informazione temporalmente più precoce, é anche costituito dalla valutazione degli incrementi delle concentrazioni di tali marcatori nel plasma ("slope") (7).
In corso di interventi di angioplastica, le isoforme della CK-MB, al pari di altri marcatori, evidenziano valori post-procedurali significativamente aumentati rispetto ai basali nei pazienti con complicazioni, mentre negli interventi non complicati non si osservano differenze significative tra valori pre- e post-procedura. Se, tuttavia, si valuta la precocità con cui i diversi marcatori sono in grado di fornire l'informazione, il primo incremento significativo è mostrato proprio dal rapporto MB2/MB1, a circa 2 ore dall'intervento, seguito da quello della CK-MB e della cTnT a 6 ore e della CK totale dopo 12 ore (8).

LIMITI ALL'IMPIEGO CLINICO DELLEISOFORME DELLA CK-MB
Come già detto, i valori del rapporto delle isoforme della CK-MB nel plasma dipendono dall'entità di rilascio dell'enzima tissutale nel circolo ematico e dall'attività dell'enzima carbossipeptidasi N che, catalizzando la rimozione della lisina terminale, dà origine all'isoforma trasformata, CK-MB1. Dal momento che la sensibilità e l'accuratezza diagnostica delle isoforme per la diagnosi di IMA dipendono anche dalla loro velocità di conversione, una possibile interferenza sulle prestazioni diagnostiche di tale marcatore può essere data dai livelli di attività della carbossipeptidasi N. A questo proposito, un nostro studio ha evidenziato come esista una notevole variabilità intra-individuale nei valori di attività di questo enzima nei soggetti sani e come, nei soggetti che hanno subito un IMA, l'attività dello stesso nel sangue aumenti più tardivamente rispetto al suo substrato (la CK-MB2 e, più in generale, l'attività creatinchinasica), al punto che valori di attività significativamente diversi sono stati rilevati prima e dopo la normalizzazione del rapporto MB2/MB1 (Figura I) (9). Questo tipo di comportamento sembra suggerire l'esistenza di una sorta di induzione nella sintesi dell'enzima carbossipeptidasi N da parte del suo substrato. Al di là di questo aspetto, che può in parte spiegare la precocità di normalizzazione di questo marcatore, il modo più diretto con cui la carbossipeptidasi N può incidere sulla efficacia diagnostica delle isoforme è rappresentato dalla sua concentrazione basale. Nello studio precedentemente citato (9), infatti, due pazienti con IMA, caratterizzati da elevati valori basali di carbossipeptidasi N, hanno mostrato risultati normali per il rapporto delle isoforme CK-MB durante tutto il periodo di monitoraggio. Ciò può essere in parte anche messo in relazione con quanto riportato da altri studi, nei quali soggetti senza IMA ma con valori particolarmente bassi di carbossipeptidasi N, risultavano falsamente positivi per le isoforme della CK (10).
Un secondo fattore che può rappresentare un limite all'utilizzo diagnostico delle isoforme della CK-MB è rappresentato dall'aspetto analitico. Fino a pochi anni fa erano disponibili solo metodi di separazione fisica, che sfruttando la differenza di carica elettrica tra la forma tissutale e quella trasformata, erano in grado di separarle e quindi di identificarle. Si trattava per lo più di sistemi con lunghi tempi di esecuzione, che spesso richiedevano un pre-trattamento del campione e che quindi non erano applicabili alle situazioni di emergenza, come invece si richiede per un marcatore biochimico da usare per la diagnosi precoce di IMA e la valutazione dell'efficacia della terapia trombolitica (1). In anni più recenti, sono stati proposti metodi immunologici che però per lo più hanno fornito risultati abbastanza deludenti. Una recente valutazione di un metodo di immunoestrazione che consente di dosare l'isoforma CK-MB2 ha rilevato una significativa interferenza da parte dell'isoenzima CK-MM, che risulta rilevante se si considera che tale isoenzima viene comunque rilasciato in seguito a danno miocardico (11). In un altro studio, i risultati ottenuti si discostavano significativamente da quelli attesi all'aumentare della concentrazione della isoforma di origine tessutale (CK-MB2), indicando un'elevata crossreattività dell'anticorpo utilizzato tra le due isoforme (12).

Il metodo dell'elettroforesi ad alto voltaggio appare quindi a tutt'oggi il più praticabile per la separazione delle isoforme, esistendo tra l'altro in commercio un sistema ottimizzato ed automatizzato. Tale strumento ha consentito di ridurre i tempi analitici da 90 a 25 min, comprendendo anche la fase di lettura densitometrica del tracciato elettroforetico, anch'essa automatizzata. Con quest'ultima procedura, la sensibilità analitica risulta significativamente migliorata, in quanto è possibile rilevare la positività del rapporto tra le isoforme già in campioni ottenuti al ricovero del paziente con sospetto IMA, nei quali il metodo di generazione precedente forniva un'elevata percentuale di risultati negativi (3).

CONCLUSIONI
Le isoforme della CK-MB rappresentano un marcatore caratterizzato da una buona sensibilità diagnostica per la diagnosi di IMA, ma il cui utilizzo nella pratica clinica risulta limitato sia da problemi di tipo fisiopatologico che analitico. I primi sono legati all'ampia variabilità individuale dell'attività basale della carbossipeptidasi N, che può essere all'estremo responsabile anche di risultati falsamente negativi. I problemi analitici, dovuti fondalmentalmente alla scarsa sensibilità analitica e ai lunghi tempi di esecuzione delle procedure, sono stati in parte risolti dalla strumentazione di ultima generazione.

Trattandosi di un marcatore dotato di sensibilità clinica paragonabile a quella della mioglobina, marcatore precoce per eccellenza, rispetto alla quale però possiede una specificità significativamente superiore, le isoforme dell'isoenzima CK-MB possono trovare una collocazione in quelle realtà in cui la scelta, anziché orientata all'utilizzo di due marcatori, uno molto sensibile in fase precoce e uno molto specifico, venga effettuata utilizzando un unico marcatore che possa fornire un buon compromesso in termini di sensibilità e specificità.

BIBLIOGRAFIA

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RELAZIONI

Approccio clinico al paziente con sospetta sindrome coronarica acuta
M. Galvani*, D. Ferrini, F. Ottani
Unità di Ricerca Cardiovascolare, Fondazione Myriam Zito Sacco, Forlì
Divisione di Cardiologia, Ospedale G.B. Morgagni, Forlì

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M. Panteghini*, C. cuccia, F. Pagani, G. Bonetti
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Divisione di Cardiologia, Spedali Civili e Cattedra di Cardiologia, Università, Brescia

CK-MB: dalla misura dell'attività catalitica a quella della concentrazione proteica
M. Zaninotto
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La determinazione delle isoforme della CK-MB nel nuovo panorama biochimico
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Glycogen phosphorylase isoenzyme BB: a novel enzyme marker for the diagnosis of ischemic myocardial damage
Johannes Mair
Institut für Medizinische Chemie & Biochemie, University of Innsbruck, Austria

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