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Percorso: Homepage - Editoria - Indice Biochimica Clinica - Numero 10/1998 - Fosfatasi alcalina ossea: quale metodo?
BIOCHIMICA CLINICA: NUMERO 10/1998
Relazioni del Convegno
"Il laboratorio nella diagnostica delle malattie del tessuto osseo"
Fosfatasi alcalina ossea: quale metodo?
INTRODUZIONE
LA FOSFATASI ALCALINA OSSEA
METODI DI DETERMINAZIONE
METODI ELETTROFORETICI
METODI DI PRECIPITAZIONE SELETTIVA
METODI IMMUNOLOGICI
Tabella I
Complessivamente è possibile affermare che i metodi immunochimici risultano più facili da utilizzare, ponendosi quindi come valida alternativa all'elettroforesi, specialmente per quelle realtà in cui non sia possibile eseguire la separazione elettroforetica completa delle forme molecolari della AP. Data la parziale crossreattività degli anticorpi anti-BAP utilizzati verso l'isoforma epatica dell'enzima, non è tuttavia esclusa la possibilità che sieri di pazienti con marcati incrementi di AP epatica possano mostrare falsi aumenti della BAP determinata con i test immunoassistiti, limitando il valore diagnostico di tali test in questi casi. Per chiarire definitivamente questo aspetto sono comunque necessari ulteriori studi clinici.
BIBLIOGRAFIA
RELAZIONI
Fosfatasi alcalina ossea: quale metodo?
Problematiche di standardizzazione nella determinazione dell'osteocalcina
Marcatori di riassorbimento osseo derivati dal collagene di tipo I: alternativi o da integrare?
Variabilità biologica dei marcatori biochimici ossei: significato e implicazioni pratiche
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M. Panteghini
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia
La fosfatasi alcalina (AP) è una glicoproteina a struttura dimerica contenente zinco, che catalizza l'idrolisi a pH alcalino di numerosi fosfomonoesteri. Essa è specificatamente associata a membrane citoplasmatiche e microsomi delle cellule della mucosa dell'intestino tenue e del tubulo convoluto prossimale del rene, degli osteoblasti, degli epatociti e del sinciziotrofoblasto placentare. L'esatto ruolo fisiologico dell'enzima non è stato stabilito ma si pensa che esso intervenga nel processo di calcificazione dell'osso. Il fatto che individui con una mancanza congenita dell'enzima mostrino un'abbondante escrezione di etanolamina fosfato suggerisce che questo, o forse la fosfatidiletanolamina, possa essere uno dei substrati fisiologici dell'enzima (1).
Utilizzata per la prima volta nella diagnostica delle malattie ossee da Robinson nel 1923, la AP venne in seguito largamente studiata ed applicata. Una svolta essenziale par l'interpretazione del significato clinico di questo enzima fu il riconoscimento della sua eterogeneità molecolare e la possibilità di applicare l'analisi isoenzimatica per identificare le varie forme in cui può presentarsi nel siero in diverse e specifiche situazioni anatomo-cliniche (2). Si sa ora che tale eterogeneità è in parte dovuta a fattori genetici ed in parte a modificazioni post-translazionali. Quattro loci genetici codificano rispettivamente l'AP placentare, l'AP germinale (o simil-placentare), l'AP intestinale e l'enzima presente nel fegato, nel rene e nell'osso (AP tessuto-aspecifica). Per quest'ultimo, le caratteristiche tessuto-specifiche vengono introdotte durante l'espressione del locus genetico nei differenti tipi di cellule con modificazioni post-translazionali. In particolare, le principali differenze nelle fosfatasi tessuto-aspecifiche originano da differenze nella composizione dei carboidrati della glicoproteina (3).
Sebbene la sua precisa funzione biochimica sia sconosciuta, sappiamo tuttavia con certezza che la AP ossea (BAP) è un ectoenzima dell'osteoblasto (4). Ancorata alla parte esterna della membrana citoplasmatica mediante una molecola di fosfatidilinositolo, la BAP può essere rilasciata nella circolazione sanguigna per azione di fosfolipasi endogene.
Precedenti studi clinici hanno dimostrato che la determinazione quantitativa della BAP nel siero può fornire un utile indice della velocità di formazione dell'osso (5). Tuttavia, il suo impiego clinico è stato limitato per molto tempo dalla difficoltà di determinarla accuratamente. L'argomento della specificità analitica è infatti centrale nella determinazione della BAP nel siero in quanto questo normalmente contiene attività fosfatasiche derivate, oltre che dallo scheletro, anche dal fegato, dall'intestino e, durante la gravidanza, anche dalla placenta. Soprattutto, risulta difficile distinguere AP ossea ed epatica che, come già detto, differiscono solo rispetto a modificazioni post-translazionali.
Un'ampia varietà di metodi è stata proposta per determinare la BAP, metodi sostanzialmente basati su approcci separativi (es. a-elettroforesi), non separativi (es. inattivazione al calore) ed immunochimici. Alcuni di questi, come l'inattivazione al calore, hanno oggi soltanto un valore storico e per questo motivo non verranno trattati in questa rassegna.
L'elettroforesi zonale seguita dalla colorazione dell'attività enzimatica con una specifica reazione (es. a-naftil fosfato come substrato e sale di diazonio come rivelatore) è senz'altro la tecnica più utilizzata nel caso si voglia studiare il quadro completo delle forme multiple della AP (6). Con questa tecnica, l'AP ossea ed epatica possono essere tuttavia valutate solo visivamente, la sovrapposizione tra le due frazioni rendendo impossibile la loro quantificazione mediante densitometria. Moss e Edwards, sfruttando la maggiore suscettibilità al trattamento con neuraminidasi della BAP rispetto alla AP epatica e la conseguente diversa alterazione delle cariche elettriche delle due frazioni, per primi hanno dimostrato come l'impiego di questo approccio, preventivamente alla migrazione elettroforetica, consenta di separare con più risoluzione, e quindi di quantificare attraverso densitometria, le due principali frazioni sieriche (7). L'elettroforesi con breve (15 min) pretrattamento del campione con neuraminidasi, sebbene relativamente indaginosa, rimane ancor'oggi, in termini di precisione ed accuratezza, il metodo a cui far riferimento per la determinazione della BAP. In particolare, quando correttamente standardizzato, esso consente di ottenere livelli di imprecisione che rispettano l'obiettivo analitico stabilito attraverso lo studio della variabilità biologica dell'enzima (CVtotale del metodo £3.3%) (8).
Alternativamente al trattamento con neuraminidasi, Rosalki e Foo hanno suggerito la modificazione dell'elettroforesi convenzionale mediante l'aggiunta nel tampone di migrazione di lectina da germe di grano (WGL) per ottenere il miglioramento della separazione tra BAP e AP epatica, vista l'affinità della WGL per i residui di N-acetilglucosammina presenti sulla BAP, con conseguente rallentamento migratorio di quest'ultima (9). Tale approccio, sostituendo l'elettroforesi con una precipitazione in provetta, è stata la base su cui è stato sviluppato il primo metodo commerciale non elettroforetico per la determinazione selettiva della BAP (Iso-ALP, Boehringer Mannheim) (10). Abbastanza semplice da utilizzare, il metodo mostra tuttavia chiari limiti nell'accuratezza e nella precisione della determinazione. Un primo problema è dovuto alla diversa reattività della WGL, ottenuta da diverse fonti e da diversi lotti, con un'attività di legame della BAP che può arrivare anche a solo il 70% del totale della BAP presente nel siero, con conseguente sua significativa sottostima (11). Ancora più importante il fatto che alcune forme di BAP presenti in neonati e nel corso di alcune patologie ossee non sembrano reagire con la WGL a causa della eterogeneità dei residui glicosilici, probabilmente dipendente dall'età e dallo stato metabolico del soggetto, con sottostime fino a valori di oltre il 45% in soggetti con malattia di Paget (12, 13). Infine, il metodo WGL si è rivelato sostanzialmente impreciso, con CVtotale ripetutamente >11%, sia in esperienze isolate che multicentriche (14, 15).
Numerosi autori hanno tentato in passato di determinare selettivamente la BAP per mezzo di anticorpi policlonali, ma senza alcun successo. Ciò non deve tuttavia sorprendere se si pensa alla stretta similarità strutturale della BAP con la forma epatica e la conseguente elevata cross-reattività degli antisieri. Tale difficoltà è inoltre perdurata anche dopo l'introduzione dell'impiego in analitica degli anticorpi monoclonali (MoAb), tanto che per tutto il corso degli anni `80 molti gruppi di ricercatori hanno prodotto e valutato MoAb, che erano sostanzialmente incapaci di distinguere con accuratezza le due principali forme sieriche di AP (16). L'inizio della generazione attuale dei test immunochimici si può far risalire al lavoro di Hill e Wolfert, ricercatori della Hybritech di San Diego in California, che nel 1989 annunciarono l'isolamento di una serie di MoAb contro la BAP, con una crossreattività per la forma epatica £8.5% (17). Utilizzando due di questi MoAb, questa ditta ha sviluppato e commercializzato un test immunoradiometrico (Tandem-R Ostase, risultati espressi in concentrazione di massa), disponibile sul mercato a partire dal 1993 (18). In questi 5 anni, numerosi gruppi di ricercatori hanno valutato questo metodo, soprattutto nelle due principali caratteristiche dell'inaccuratezza e dell'imprecisione (19-25). Relativamente al problema della crossreattività della AP epatica, i dati forniti, ottenuti con vari tipi di approcci sperimentali, sono ormai concordi nell'evidenziare un'interferenza media compresa tra 12.7% e 16.5% da parte della AP epatica nel metodo Ostase (20, 21, 23-25). Per quanto riguarda l'imprecisione, tale metodo non sembra fornire risultati accettabili in funzione del "goal" analitico precedentemente riportato (CVtotale £3.3%). Infatti, su una concentrazione media di circa 20 mg/L di BAP (valore medio in un soggetto sano), l'imprecisione totale riportata si aggira mediamente tra 8.3% e 10.3%, pari a circa tre volte il limite di precisione accettabile (19-22, 24, 25). È indubbio che la prevalente componente manuale nell'esecuzione della procedura può in parte influenzare tale risultato.
Nel 1995, viene commercializzato un secondo test immunoassistito (Alkphase-B, Metra Biosystems) che sfrutta la reattività di un MoAb per immunoadsorbire la BAP dal siero al fine di determinarne direttamente l'attività catalitica (26). Essendo il test di più recente introduzione, ci sono in letteratura informazioni un po' meno omogenee rispetto al metodo precedente. È stato dimostrato un ottimo recupero (valori medi intorno al 99.5%) della forma ossea, con reattività praticamente assente o scarsa, comunque <2%, nei confronti degli isoenzimi placentare ed intestinale (27, 28). Disomogenei sono invece i dati relativi alla possibile interferenza dovuta alla AP epatica, con valori che vanno da 5.9% a 20.0% (25, 28-32). È indubbio che la valutazione della crossreattività della forma epatica è oltremodo complessa nel caso in cui la differenza epitopica dipenda, come per le AP epatica ed ossea, unicamente da modificazioni posttranslazionali e differenze nella struttura terziaria delle due molecole. D'altronde, l'impiego di enzima estratto da omogenati di fegato, che mostrava in una nostra esperienza una crossreattività pari a circa il 40%, non può considerarsi un accettabile surrogato, a causa delle significative modificazioni a cui l'enzima è sottoposto quando rilasciato nello spazio intravasale (28). Per questi motivi, è stato recentemente riconsiderato nel nostro Laboratorio il problema, utilizzando 18 diversi sieri con valori aumentati di AP epatica, sui quali erano determinate la BAP e la AP epatica con metodo elettroforetico dopo breve pretrattamento con neuraminidasi e la BAP anche con metodo Alkphase-B. La Tabella I mostra i risultati, con una interferenza media della AP epatica sierica sul test Alkphase-B pari a 9.2%, ma con valori molto differenti da siero a siero (da un'interferenza praticamente assente in alcuni sieri si passa a crossreattività >20% in altri). Anche per quanto riguarda la precisione del metodo esistono pochi e discordanti dati, uno solo dei quali, che riporta un CV = 8.4%, ottenuto con un protocollo di valutazione accettabile (32). Tale dato farebbe pensare ad un'imprecisione molto simile a quella del test Ostase, comunque non soddisfacente. A questo proposito, l'automazione dei test immunochimici, in corso di studio da parte di alcune ditte, potrebbe risolvere questo importante problema (33, 34).
Reattività del metodo Alkphase-B per la determinazione della fosfatasi alcalina (AP) ossea nei confronti della forma molecolare epatica dell'enzima.
*: Attività fosfatasica espressa a 25 °C
Caso No. AP epatica, U/L
(elettroforesi)*AP ossea, U/L
(elettroforesi)*AP ossea, U/L
(Alkphase-B™)*Crossreattività
Alkphase-B™, %**
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
1848.0
157.8
56.4
49.2
80.4
44.4
52.8
32.4
58.8
36.6
52.5
58.8
48.0
114.0
93.6
45.6
57.0
68.418.7
11.8
10.4
16.0
34.7
33.4
20.1
26.0
11.0
21.5
15.5
33.5
15.9
29.5
11.8
15.8
15.4
17.518.9
34.9***
23.9
19.7
37.1
33.5
26.4
33.1***
17.1
21.6
23.9
64.5
18.4
37.6***
22.5
15.9
25.2
26.80.4
14.6
23.9
7.5
3.0
0.1
11.9
21.9
10.4
0.2
16.1
1.7
5.2
7.1
11.4
0.1
17.2
13.6
Media ± DS: 9.2±7.6
**: Determinata come [(AP ossea Alkphase-B - AP ossea elettroforesi)/AP epatica elettroforesi]%
***: Pazienti con risultati falsi-positivi per la AP ossea, quando misurata con Alkphase-B
M. Panteghini
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia
G. Banfi
Servizio Integrato di Medicina di Laboratorio, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Milano
M. Zaninotto, D. Bernardi, F. Ujka, M. Plebani
Servizio di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera di Padova, Padova
F. Pagani, M. Panteghini
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia
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