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Percorso: Homepage - Editoria - Indice Biochimica Clinica - Numero 10/1998 - Problematiche di standardizzazione nella determinazione dell'osteocalcina
BIOCHIMICA CLINICA: NUMERO 10/1998
Relazioni del Convegno
"Il laboratorio nella diagnostica delle malattie del tessuto osseo"
Problematiche di standardizzazione nella determinazione dell'osteocalcina
Il recente esplosivo sviluppo dello studio biochimico del metabolismo osseo ha centrato maggiormente l'attenzione sull'efficienza clinica dei diversi marcatori studiati, non sempre soffermandosi a sufficienza sugli aspetti prettamente analitici degli stessi: precisione e accuratezza, compreso il problema della standardizzazione.
BIBLIOGRAFIA
RELAZIONI
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Problematiche di standardizzazione nella determinazione dell'osteocalcina
Marcatori di riassorbimento osseo derivati dal collagene di tipo I: alternativi o da integrare?
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G. Banfi
Servizio Integrato di Medicina di Laboratorio, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Milano
Tale problema è particolarmente rilevante per l'osteocalcina, uno dei primi e più diffusi parametri utilizzati per lo studio del metabolismo osseo. Da più parti si è discusso criticamente dell'efficienza di tale parametro, in considerazione della sua variabilità analitica, legata prevalentemente ad una ridotta comparabilità dei dati, ottenuti in assenza di un comune standard internazionale (1). In realtà nessun marcatore biochimico dell'osso presenta programmi di standardizzazione internazionale ed anzi vi sono parametri, in particolare quelli urinari di riassorbimento, che risentono molto di più dell'assenza di tale uniformazione. La necessità di ripensare la materia traspare chiaramente dalle strategie suggerite dal Comitato costituito dalla Federazione Internazionale di Chimica Clinica (IFCC) ("Committee on Markers for Bone Turnover and Bone Disease"), che in particolare prevedono:
In particolare, per l'osteocalcina non esiste uno standard accettato internazionalmente; ogni produttore estrae la proteina direttamente dall'osso, solitamente mediante metodiche indaginose (3). Nella maggior parte dei casi viene utilizzato l'osso di origine bovina, di più facile reperimento e di più bassi costi. Alcuni kit utilizzano invece standard di origine umana. In generale, si può ritenere che le discrepanze dovute alla specie-specificità dell'antigene siano limitate, dato che durante la filogenesi la proteina si è fortemente conservata, tanto che solo due amminoacidi su 49 differiscono tra osteocalcina bovina ed umana. Si ritiene comunque che la possibile produzione di osteocalcina umana ricombinante possa significativamente migliorare la situazione (2).
Da quanto detto, si intuisce che i problemi di variabilità nel dosaggio dell'osteocalcina sono imputabili solo parzialmente a problematiche di standardizzazione, mentre cruciali sono gli aspetti relativi alla specificità degli anticorpi anti-osteocalcina utilizzati e alla fase preanalitica. Alcuni anni fa, un laboratorio di riferimento scelse 11 sieri provenienti da pazienti con varie patologie metaboliche ossee, chiedendo a otto differenti laboratori, che utilizzavano 12 diversi antisieri, di dosarne la concentrazione di osteocalcina. Il laboratorio di riferimento fornì anche uno standard di origine bovina per la costruzione da parte dei vari partecipanti di una curva di calibrazione comune, da confrontare con quella ottenuta da ciascun laboratorio. In tutti i casi le curve derivanti dagli standard originali e dallo standard comune mostravano un buon parallelismo e, soprattutto, l'uso di uno standard comune non consentiva di eliminare le differenze esistenti tra i diversi metodi di dosaggio. Era in particolare evidente che l'eterogeneità degli antisieri era il principale responsabile delle maggiori discrepanze. Complessivamente, quindi, le differenze dovute alla diversità tra gli anticorpi risultavano più significative di quelle imputabili alla mancanza di standardizzazione. Necessita tuttavia ricordare che la comparazione tra i diversi metodi impiegati forniva ottimi coefficienti di correlazione e che, soprattutto, le differenze tra i dati ottenuti con i diversi metodi non sembravano inficiare il significato clinico del dato.
Problema fondamentale alla base dell'eterogeneità dei dati ottenibili con i diversi metodi per il dosaggio dell'osteocalcina è l'impiego di anticorpi dotati di differente specificità. In particolare, sono presenti in commercio kit che impiegano anticorpi monoclonali o policlonali, con un differente comportamento nei confronti della molecola intatta di osteocalcina e dei frammenti che derivano dalla sua degradazione. Nonostante la proteina possieda praticamente solo quattro regioni chiaramente riconoscibili dagli anticorpi, trattandosi di una molecola molto raccolta con i terminali carbossilico e amminico tra loro vicini ed appaiati, vi può esser notevole eterogeneità generata dal diverso riconoscimento dei suoi frammenti catabolici. Infatti l'osteocalcina, molecola costituita da 49 amminoacidi, risulta intatta in circolo solo per il 36%; essa va incontro facilmente a frammentazione con la liberazione, ad esempio, di un frammento 1-43 ("mid-molecule fragment"), riconoscibile da molti anticorpi reattivi verso la molecola intera. Altri frammenti derivati dall'osteocalcina, e che possono variabilmente esser riconosciuti come molecola intera, sono l'1-19, il 20-43, il 44-49 e il 20-49. È necessaria quindi da parte dei produttori una conoscenza più accurata della specificità degli anticorpi impiegati al fine di poter correttamente giudicare il comportamento dei kit e valutare la comparabilità dei dati. È evidente che, per ragioni commerciali, l'ottenimento di tali informazioni è spesso difficoltoso, ma tuttavia questa informazione rimane un requisito fondamentale per stimare la qualità dei dati ottenibili.
Un'altra causa estremamente importante di eterogeneità dei risultati della determinazione dell'osteocalcina è rappresentata dalle variabili insite nella fase preanalitica di questo dosaggio. La molecola dell'osteocalcina tende, come detto, a frammentarsi "in vitro" ad opera di vari enzimi proteolitici. Per l'esecuzione del dosaggio è opportuno utilizzare siero, conservando il prelievo in acqua ghiacciata fino al momento della centrifugazione o aggiungendo sostanze antiproteolitiche, come l'aprotinina, e separando il siero dalla parte corpuscolata prima possibile, preferibilmente impiegando una centrifuga refrigerata. Bisogna inoltre evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti ed evitare assolutamente l'emolisi che comporta una significativa riduzione della concentrazione dell'osteocalcina per la liberazione dagli eritrociti di enzimi che la attaccano e la degradano (5).
In conclusione, un corretto approccio di standardizzazione del dosaggio dell'osteocalcina non deve prevedere solamente un processo di omogeneizzazione dei calibratori, ma deve coinvolgere anche la verifica della specificità degli anticorpi utilizzati nei vari metodi e il controllo delle modalità di raccolta e conservazione del campione biologico, visto che questi due fattori possono incidere pesantemente sulla variabilità del dato e, in ultima analisi, sulla sua interpretazione clinica.
M. Panteghini
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia
G. Banfi
Servizio Integrato di Medicina di Laboratorio, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Milano
M. Zaninotto, D. Bernardi, F. Ujka, M. Plebani
Servizio di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera di Padova, Padova
F. Pagani, M. Panteghini
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia
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