La notevole varietà di marcatori biochimici di riassorbimento osseo attualmente disponibili in commercio rende necessaria una attenta valutazione del tipo di informazione che tali marcatori sono in grado di fornire e, quindi, del rapporto tra costo e beneficio che può derivare dal loro dosaggio, anche al fine di razionalizzare i mezzi e le risorse di cui il Laboratorio dispone. Tale valutazione va effettuata non solo ponendo in relazione tra loro le informazioni ottenibili dal dosaggio di questi nuovi marcatori, ma anche confrontandole con quelle derivate dal dosaggio dei marcatori biochimici di formazione e di riassorbimento osseo tradizionali (1). È noto, infatti, come il tessuto osseo sia sottoposto ad un continuo rimaneggiamento che comporta l'alternanza di processi di riassorbimento e di neodeposizione con un equilibrio più o meno bilanciato. Ad esempio, in una condizione frequente come l'osteoporosi, si osserva non solo l'incremento atteso delle concentrazioni dei marcatori di riassorbimento, ma anche quello dei marcatori di neoformazione (2). La misurazione delle concentrazioni di entrambi, che diventa quindi irrinunciabile, consente di rilevare al meglio l'incremento significativo di turnover osseo rispetto a soggetti in età premenopausale (3).
Ogni valutazione relativa all'utilizzo dei marcatori biochimici non può prescindere da una attenta revisione critica dei vantaggi e degli svantaggi che il loro dosaggio presenta. Se da un lato è riconosciuto che si tratta di test non invasivi, con buona ripetibilità, con ampie variazioni in corso di patologia ossea e in grado di integrare, con informazioni dinamiche, i dati densitometrici, dall'altro essi presentano dei limiti conosciuti che riguardano prevalentemente le caratteristiche di sensibilità e specificità delle metodologie analitiche utilizzate. Importanti sono inoltre, specialmente per misurazioni eseguite su campioni di urine, gli aspetti di standardizzazione delle fasi preanalitiche, che devono considerare il tipo di campione in relazione alle variazioni diurne dell'escrezione urinaria dei singoli metaboliti. Per un approccio critico all'utilizzazione dei marcatori diventa quindi fondamentale, prima di definire la loro validità clinica, valutarne le caratteristiche biologiche oltre che considerare gli aspetti preanalitici e analitici del loro dosaggio (4).

CARATTERISTICHE BIOLOGICHE
Mentre le caratteristiche di specificità tissutale dei marcatori di metabolismo osseo sono abbastanza note, le conoscenze sul loro destino metabolico non sono altrettanto consolidate (5). Ad esempio, i derivati del piridinio sembrano essere escreti nelle urine come molecola apparentemente invariata, mentre, a differenza che per l'idrossiprolina, metabolizzata per il 90% a livello epatico, sembra assente un catabolismo epatico per N-telopeptide del collagene di tipo I (NTx), per il peptide carbossiterminale dello stesso (CROSSLAPS) e per la galattosilidrossilisina (GHYL).
I dati della letteratura, inoltre, documentano un significativo ritmo diurno per idrossiprolina, NTx e per i derivati del piridinio (6, 7), per i quali è stato misurato il picco di escrezione urinaria tra le ore 5 e 8 del mattino e il nadir tra le 14 e le 23, con una una diminuzione media del 25-35% rispetto all'escrezione media sul campione delle 24 ore. In un nostro studio effettuato su una popolazione di donne osteopeniche in età menopausale, si sono evidenziate escrezioni urinarie minime nel campione raccolto tra le ore 15 e le 22 e picchi di escrezione nel campione di urine della notte per tutti i marcatori di riassorbimento considerati. In questi due momenti di raccolta le concentrazioni di NTx e CROSSLAPS sono risultate significativamente diverse.
Per alcuni marcatori sono già disponibili informazioni relative alla variabilità biologica consentendo così il raggiungimento di una prima importante tappa verso la conoscenza della differenza critica significativa tra successive misurazioni. Alcuni autori osservano per i derivati del piridinio una variabilità intraindividuale caratterizzata da un CV compreso tra 20 e 30% (8). Altri hanno dimostrato come per le piridinoline la variabilità intraindividuale non dipenda dal sesso, diversamente dalla variabilità interindividuale, che risulta maggiore nei maschi rispetto alle femmine (9). Inoltre, variabilità intra- e intersoggetto sembrano ridursi significativamente quando i risultati vengono espressi come rapporto tra concentrazioni di piridinolina e di creatinina, cosicchè la differenza necessaria perché risultati seriali siano significativamente diversi si riduce a circa il 50% (9).

ASPETTI PREANALITICI ED ANALITICI

STANDARDIZZAZIONE DEL TIPO DI RACCOLTA URINARIA
Le osservazioni relative alla variazione diurna nell'escrezione urinaria dimostrano come l'effettiva utilità dei marcatori di riassorbimento non possa essere completamente valutata in assenza di una standardizzazione del tipo di raccolta del campione di urina da utilizzare per il loro dosaggio. Tale standardizzazione si rende particolarmente necessaria non solo perché è importante confrontare i dati della letteratura che, invece, spesso riportano concentrazioni di metaboliti misurate in differenti condizioni, ma anche per garantire l'identificazione del tipo di campione in grado di fornire informazioni più sensibili riguardanti l'entità del riassorbimento osseo.
Esistono sufficienti evidenze per affermare che la raccolta di urine della notte con il campione del primo mattino è la più idonea per valutare l'escrezione di tutti i marcatori di riassorbimento attualmente disponibili, fornendo in ogni caso informazioni sovrapponibili (9).

PROBLEMI METODOLOGICI
Tra i marcatori di riassorbimento osseo, i derivati del piridinio, escreti sia in forma libera (40% del totale) che legata a peptidi (60%), sono i soli che possono essere dosati con due differenti metodi analitici. La determinazione con metodo cromatografico delle piridinoline totali richiede il rilascio della forma legata a peptidi attraverso una preventiva fase di idrolisi acida che può, tuttavia, provocare una parziale degradazione dell'analita e quindi una sottostima dei crosslinks totali. Il metodo cromatografico, inoltre, presenta problemi di standardizzazione e di variabilità dei risultati tra laboratori, tempi di esecuzione prolungati, costi elevati e una difficile diffusione nei piccoli laboratori. Questo tipo di problema può essere superato utilizzando metodi immunoenzimatici, per i quali sono disponibili anticorpi poli- e monoclonali, che sembrano correlare significativamente con i metodi in HPLC (10, 11). I dati ottenuti con i due metodi sembrano, inoltre, fornire informazioni cliniche sovrapponibili nello studio di pazienti con diverse patologie ossee, dimostrando la notevole specificità del metodo immunometrico.

VALIDITÀ CLINICA
Qualsiasi considerazione sulla validità clinica dei marcatori non può prescindere dalla valutazione della qualità delle informazioni che si possono ricavare dal loro dosaggio.

Informazioni quantitative.  I dati riportati nella Tabella I evidenziano come siano notevolmente differenti le informazioni che i vari marcatori forniscono sull'entità di osso riassorbito, quando queste vengano espresse in equivalenti di collagene osseo ("Bone Collagen Equivalent", BCE). Sono quindi necessari ulteriori studi per valutare la potenziale utilità dei marcatori nel fornire informazioni quantitative e per definire l'accuratezza del singolo dosaggio, necessitando confermare, per esempio, la specificità di legame dell'anticorpo impiegato verso i peptidi del collagene osseo nel dosaggio del peptide NTx del collagene tipo I o dei CROSSLAPS.

Informazioni specifiche.  La possibilità che i marcatori di riassorbimento osseo siano da ritenere tra loro alternativi oppure che il loro dosaggio fornisca informazioni da integrare può essere valutata anche in relazione alla loro specificità tissutale nei confronti dell'osso corticale o dell'osso trabecolare. Benchè in letteratura sia modesto il numero di lavori che studiano le caratteristiche di composizione del collagene corticale e trabecolare, molto interessanti sono i risultati di un recente lavoro che sembrano dimostrare come l'entità dei processi di glicosilazione sia maggiore nell'osso trabecolare rispetto al corticale (12). In quest'ultimo, infatti, sembra maggiore la quantità di idrossilisina rispetto all'osso trabecolare nel quale, invece, insieme alla prevalenza di residui glicosilati, risulta scarsa la presenza di crosslinks del piridinio.

Tabella I
Espressione dei valori urinari (escrezione media in maschi adulti) dei vari prodotti di degradazione del collagene di tipo I in Equivalenti di Collagene Osseo (BCE).

Marcatore	Valori relativi	vs.	Valori Assoluti
Desossipiridinolina	4.0 nmol/mmol creatinina	vs.	140 nmol BCE*/mmol creatinina
CROSSLAPS	196 µg/mmol creatinina	vs.	140 nmol BCE*/mmol creatinina
NTx			40 nmol BCE*/mmol creatinina

In un lavoro condotto recentemente su 124 pazienti sottoposti a trapianto di rene e trattati con terapia immunosoppressiva (azatioprina, ciclosporina A, prednisone), caratterizzati da una elevata perdita di massa ossea anche a 10 anni dal trapianto, sono stati osservati, durante il monitoraggio, andamenti differenti nel comportamento dei marcatori biochimici (13). Mentre si è osservato nel tempo una lenta riduzione dell'escrezione urinaria di NTx, la tendenza riscontrata nelle concentrazioni di GHYL sembrava essere opposta. Tali risultati, se confermati, potrebbero suggerire una maggior sensibilità della galattosilidrossilisina nel rilevare l'entità del ricambio a livello dell'osso trabecolare, la componente di tessuto osseo maggiormente interessata dal processo di riassorbimento in pazienti sottoposti a terapia con ciclosporina A (14).

Informazioni sensibili.  Nell'ambito di un approccio critico all'utilizzazione dei marcatori diventa fondamentale valutare, infine, la sensibilità del marcatore nella diagnosi e nel monitoraggio di pazienti affetti da patologie scheletriche o sottoposti ad idonea terapia.

Tabella II
Confornto tra i valori (media ± DS, campioni di urine del primo mattino) dei principali marcatori biochimici di riassorbimento osseo in donne osteopeniche e in un gruppo di controllo.

	Idrossiprolina, µmol/mmol cr	NTx, nmol BCE/mmol cr	PYD, nmol/mmol cr	DPD, nmol/mmol cr	CROSSLAPS, µg/mmol cr
Pazienti osteopeniche (n=30)	30.79 ± 15.50	53.34 ± 23.08	90.62 ± 66.75	15.33 ± 8.86	335.3 ± 142.8
Gruppo di controllo (n=30)	29.79 ± 9.42	54.91 ± 25.53	60.74 ± 6.90	13.02 ± 7.64	367.0 ± 171.4
P	0.784	0.824	0.039	0.333	0.492
Valori premenopausa	13.9 ± 6.9	30.4 ± 6.9	33.4 ± 8.1	5.4 ± 1.8	250 ± 110

NTx = telopeptide N-terminale del collagene di tipo I;
PYD = piridinoline;
DPD = desossipiridinolina;
cr = creatinina

In una nostra esperienza condotta su pazienti osteopeniche, tutti i marcatori di riassorbimento considerati non mostravano valori significativamente diversi rispetto a quelli riscontrati in un gruppo di controllo costituito da donne di pari età, dimostrando una minore capacità di discriminazione rispetto ai dati densitometrici (Tabella II). Questo risultato, che deve essere peraltro valutato in relazione al tipo di patologia esaminata, caratterizzata da una alterazione borderline del turnover osseo, sottolinea come nessun marcatore biochimico presenti una sensibilità adeguata a diagnosticare una fase della patologia nella quale un trattamento terapeutico opportuno può risultare particolarmente efficace.
Di particolare interesse risulta invece il confronto tra marcatori relativamente alle informazioni che il loro dosaggio fornisce nel monitoraggio della terapia. Alcuni dati della letteratura evidenziano come nel monitoraggio della terapia ormonale o con bisfosfonati i marcatori di riassorbimento osseo presentino un comportamento tra loro molto diverso. Alcuni autori riportano un decremento nell'escrezione di NTx in corso di trattamento con bisfosfonati del 60-80% rispetto ai valori basali, mentre per le piridinoline la variazione media è del 40% (8). In soggetti con malattia di Paget in fase attiva e trattati con bisfosfonati si dimostra un notevole decremento delle piridinoline totali, mentre non si apprezzano variazioni significative della forma libera (15). Il trattamento con estrogeni provoca, invece, un decremento considerevole dell'escrezione delle piridinoline, sia totali che libere (16). Anche l'escrezione di NTx può riflettere bene la soppressione del riassorbimento osseo legato alla terapia ormonale sostitutiva in menopausa. Tali discrepanze potrebbero essere spiegate da differenze nella specificità analitica, dalla possibilità che i marcatori riflettano differenti aspetti del processo di riassorbimento o, ancora, che la terapia induca variazioni nella produzione o nel metabolismo dei marcatori non collegate a variazioni nel riassorbimento osseo (15). Va sottolineato altresì come la diversa risposta dei marcatori alla terapia sia condizionata considerevolmente dalla variabilità biologica specifica di ciascuno: la maggiore risposta al trattamento terapeutico di alcuni indicatori rispetto ad altri potrebbe essere dovuta non solo a una elevata sensibilità, ma anche ad una loro maggiore variabilità nell'individuo.
In conclusione, quanto esposto sottolinea come per definire l'affidabilità clinica e far emergere il potenziale diagnostico del dosaggio dei marcatori di riassorbimento osseo diventi indispensabile chiarire aspetti fondamentali, quali le modalità di raccolta e di conservazione del campione, la standardizzazione dei dosaggi con utilizzazione di materiali di calibrazione ben definiti e l'uniformità di espressione dei risultati ottenuti, allo scopo di ridurre al minimo la variabilità dei risultati e consentire quindi un confronto appropriato tra i diversi studi clinici.

METODI DI PRECIPITAZIONE SELETTIVA
Alternativamente al trattamento con neuraminidasi, Rosalki e Foo hanno suggerito la modificazione dell'elettroforesi convenzionale mediante l'aggiunta nel tampone di migrazione di lectina da germe di grano (WGL) per ottenere il miglioramento della separazione tra BAP e AP epatica, vista l'affinità della WGL per i residui di N-acetilglucosammina presenti sulla BAP, con conseguente rallentamento migratorio di quest'ultima (9). Tale approccio, sostituendo l'elettroforesi con una precipitazione in provetta, è stata la base su cui è stato sviluppato il primo metodo commerciale non elettroforetico per la determinazione selettiva della BAP (Iso-ALP, Boehringer Mannheim) (10). Abbastanza semplice da utilizzare, il metodo mostra tuttavia chiari limiti nell'accuratezza e nella precisione della determinazione. Un primo problema è dovuto alla diversa reattività della WGL, ottenuta da diverse fonti e da diversi lotti, con un'attività di legame della BAP che può arrivare anche a solo il 70% del totale della BAP presente nel siero, con conseguente sua significativa sottostima (11). Ancora più importante il fatto che alcune forme di BAP presenti in neonati e nel corso di alcune patologie ossee non sembrano reagire con la WGL a causa della eterogeneità dei residui glicosilici, probabilmente dipendente dall'età e dallo stato metabolico del soggetto, con sottostime fino a valori di oltre il 45% in soggetti con malattia di Paget (12, 13). Infine, il metodo WGL si è rivelato sostanzialmente impreciso, con CVtotale ripetutamente >11%, sia in esperienze isolate che multicentriche (14, 15).

METODI IMMUNOLOGICI
Numerosi autori hanno tentato in passato di determinare selettivamente la BAP per mezzo di anticorpi policlonali, ma senza alcun successo. Ciò non deve tuttavia sorprendere se si pensa alla stretta similarità strutturale della BAP con la forma epatica e la conseguente elevata cross-reattività degli antisieri. Tale difficoltà è inoltre perdurata anche dopo l'introduzione dell'impiego in analitica degli anticorpi monoclonali (MoAb), tanto che per tutto il corso degli anni `80 molti gruppi di ricercatori hanno prodotto e valutato MoAb, che erano sostanzialmente incapaci di distinguere con accuratezza le due principali forme sieriche di AP (16). L'inizio della generazione attuale dei test immunochimici si può far risalire al lavoro di Hill e Wolfert, ricercatori della Hybritech di San Diego in California, che nel 1989 annunciarono l'isolamento di una serie di MoAb contro la BAP, con una crossreattività per la forma epatica £8.5% (17). Utilizzando due di questi MoAb, questa ditta ha sviluppato e commercializzato un test immunoradiometrico (Tandem-R Ostase, risultati espressi in concentrazione di massa), disponibile sul mercato a partire dal 1993 (18). In questi 5 anni, numerosi gruppi di ricercatori hanno valutato questo metodo, soprattutto nelle due principali caratteristiche dell'inaccuratezza e dell'imprecisione (19-25). Relativamente al problema della crossreattività della AP epatica, i dati forniti, ottenuti con vari tipi di approcci sperimentali, sono ormai concordi nell'evidenziare un'interferenza media compresa tra 12.7% e 16.5% da parte della AP epatica nel metodo Ostase (20, 21, 23-25). Per quanto riguarda l'imprecisione, tale metodo non sembra fornire risultati accettabili in funzione del "goal" analitico precedentemente riportato (CVtotale £3.3%). Infatti, su una concentrazione media di circa 20 mg/L di BAP (valore medio in un soggetto sano), l'imprecisione totale riportata si aggira mediamente tra 8.3% e 10.3%, pari a circa tre volte il limite di precisione accettabile (19-22, 24, 25). È indubbio che la prevalente componente manuale nell'esecuzione della procedura può in parte influenzare tale risultato.
Nel 1995, viene commercializzato un secondo test immunoassistito (Alkphase-B, Metra Biosystems) che sfrutta la reattività di un MoAb per immunoadsorbire la BAP dal siero al fine di determinarne direttamente l'attività catalitica (26). Essendo il test di più recente introduzione, ci sono in letteratura informazioni un po' meno omogenee rispetto al metodo precedente. È stato dimostrato un ottimo recupero (valori medi intorno al 99.5%) della forma ossea, con reattività praticamente assente o scarsa, comunque <2%, nei confronti degli isoenzimi placentare ed intestinale (27, 28). Disomogenei sono invece i dati relativi alla possibile interferenza dovuta alla AP epatica, con valori che vanno da 5.9% a 20.0% (25, 28-32). È indubbio che la valutazione della crossreattività della forma epatica è oltremodo complessa nel caso in cui la differenza epitopica dipenda, come per le AP epatica ed ossea, unicamente da modificazioni posttranslazionali e differenze nella struttura terziaria delle due molecole. D'altronde, l'impiego di enzima estratto da omogenati di fegato, che mostrava in una nostra esperienza una crossreattività pari a circa il 40%, non può considerarsi un accettabile surrogato, a causa delle significative modificazioni a cui l'enzima è sottoposto quando rilasciato nello spazio intravasale (28). Per questi motivi, è stato recentemente riconsiderato nel nostro Laboratorio il problema, utilizzando 18 diversi sieri con valori aumentati di AP epatica, sui quali erano determinate la BAP e la AP epatica con metodo elettroforetico dopo breve pretrattamento con neuraminidasi e la BAP anche con metodo Alkphase-B. La Tabella I mostra i risultati, con una interferenza media della AP epatica sierica sul test Alkphase-B pari a 9.2%, ma con valori molto differenti da siero a siero (da un'interferenza praticamente assente in alcuni sieri si passa a crossreattività >20% in altri). Anche per quanto riguarda la precisione del metodo esistono pochi e discordanti dati, uno solo dei quali, che riporta un CV = 8.4%, ottenuto con un protocollo di valutazione accettabile (32). Tale dato farebbe pensare ad un'imprecisione molto simile a quella del test Ostase, comunque non soddisfacente. A questo proposito, l'automazione dei test immunochimici, in corso di studio da parte di alcune ditte, potrebbe risolvere questo importante problema (33, 34).
Complessivamente è possibile affermare che i metodi immunochimici risultano più facili da utilizzare, ponendosi quindi come valida alternativa all'elettroforesi, specialmente per quelle realtà in cui non sia possibile eseguire la separazione elettroforetica completa delle forme molecolari della AP. Data la parziale crossreattività degli anticorpi anti-BAP utilizzati verso l'isoforma epatica dell'enzima, non è tuttavia esclusa la possibilità che sieri di pazienti con marcati incrementi di AP epatica possano mostrare falsi aumenti della BAP determinata con i test immunoassistiti, limitando il valore diagnostico di tali test in questi casi. Per chiarire definitivamente questo aspetto sono comunque necessari ulteriori studi clinici.

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RELAZIONI

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Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, Spedali Civili, Brescia

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Servizio Integrato di Medicina di Laboratorio, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Milano

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F. Pagani, M. Panteghini
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